黃曲霉毒素總殘檢測試劑盒（ELISA）

僅供科研使用，不得用于臨床檢驗

黃曲霉毒素總殘檢測試劑盒（ELISA）

（酶聯免疫法）

1 原理及用途

黃曲霉毒素是由黃曲霉菌屬的黃曲霉和寄生曲霉等產生的次級代謝產物，主要污染玉米、花生、堅果等。黃曲霉毒素以 AFB1、AFB2、AFG1 和 AFG2 這四種毒素為主，黃曲霉毒素總量一般是指這四種毒素的總量。它們是 I 類致癌物，被證明對人和動物的肝臟、腎臟等組織和器官具有很大的危害，是一類毒性很強的致癌物質。

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測谷物、花生、飼料等樣品中的黃曲霉毒素，試劑盒由預包被偶聯抗原的酶標板、辣根酶標記物、抗體、標準品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標準品或樣品溶液，樣本中的黃曲霉毒素和酶標板上預包被偶聯抗原競爭抗黃曲霉毒素抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含黃曲霉毒素含量成負相關，與標準曲線比較即可得出樣本中黃曲霉毒素的殘留量。

2 技術指標

2.1 試劑盒靈敏度：0.02ppb(ng/ml)

2.2 反應模式：25℃，30min～15min

2.3 檢測下限：

谷物……………………………………0.1ppb

配合飼料………………………………0.2ppb

食用油、花生…………………………0.2ppb

醬類、麥類等飼料……………………0.2ppb

啤酒……………………………………0.2ppb

葡萄酒、醬油、醋……………………0.1ppb

2.4 交叉反應率：

黃曲霉毒素B1…………………………100%

黃曲霉毒素B2…………………………80%

黃曲霉毒素G1…………………………75%

黃曲霉毒素G2…………………………45%

黃曲霉毒素M1…………………………8%

 2.5 樣本回收率：

谷物及配合飼料……………………85%±15%

花生…………………………………82±15%

食用油………………………………85±15%

醬類、麥類等飼料………………83±15%

啤酒………………………………84±15%

葡萄酒、醬油、醋………………87±15%

3 試劑盒組成

主要成分

標準品濃度依次為: 0ppb、0.02ppb、0.04ppb、0.08ppb、0.16ppb、0.32ppb

4 需要的器材和試劑

4.1 儀器：酶標儀、打印機、均質器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：單道20μl-200μl，100μl-1000μl、多道300μl

4.3 試劑：甲醇、正己烷、三氯甲烷或二氯甲烷 

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知：

實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實驗結果。

5.2 配液：

配液1：樣本提取液

    70%甲醇，即V甲醇:V去離子水=7：3。

5.3 樣本前處理步驟：

5.3.1 谷物處理方法 

1）稱取2g粉碎樣品于50ml離心管中，加5ml樣品提取液，振蕩5分鐘，室溫4000轉/分離心10分鐘；

2）取0.5ml上清，加入0.5ml去離子水，混勻；

3）取50μl進行分析。

    樣本稀釋倍數：5    檢測下限：0.1ppb

5.3.2 配合飼料處理方法 

1）稱取2g粉碎樣品于50ml離心管中，加10ml樣品提取液，振蕩5分鐘，室溫4000轉/分離心10分鐘；

2）取0.5ml上清，加入0.5ml去離子水，混勻；

3）取50μl進行分析。

樣本稀釋倍數：10    檢測下限：0.2ppb

（若樣本中黃曲霉毒素含量較高，可取2）步驟中已混勻的液體，以35%甲醇進行稀釋，此時樣本稀釋倍數則為實際稀釋倍數。例如：取2）步驟中液體以35%甲醇10倍稀釋，實際稀釋倍數為10×10=100，檢測下限：2ppb）

5.3.3 食用油、花生、高油脂的飼料處理方法

1）稱取2g粉碎樣品于50ml離心管中，加8ml正己烷和10ml樣品提取液，振蕩5分鐘，室溫4000轉/分離心10分鐘；

2）去除上層液體，取0.5ml下層液體加入0.5ml去離子水，混勻；

3）取50μl進行分析。

    樣本稀釋倍數：10    檢測下限：0.2ppb

5.3.4 醬類、麥類、餅干、糕點等食品或調料，以及飼料濃縮料等飼料處理方法

1）稱取2g粉碎樣品于50ml離心管中，加10ml樣品提取液，振蕩5分鐘，室溫4000轉/分離心10分鐘；

2）取2ml上清，加入4ml三氯甲烷（或二氯甲烷），振蕩5分鐘，室溫4000轉/分離心10分鐘；

3）轉移上層液體到另一容器中，下層液留置備用，向上層液中再加入4ml三氯甲烷（或二氯甲烷），充分振蕩混5分鐘，室溫4000轉/分離心10分鐘；

4）去除上層液體，合并兩次的下層液體并充分混勻；

5）取合并后的下層液體2ml于50-60℃氮氣下吹干；

6）加入0.5ml樣品提取液充分溶解干燥物，再加入0.5ml去離子水混勻；

7）取50μl進行分析。

    樣本稀釋倍數：10    檢測下限：0.2ppb

5.3.5 啤酒處理方法

1）將啤酒充分攪拌（去除CO2），取2ml啤酒樣品，加入1ml蒸餾水，再加入7ml甲醇，振蕩5分鐘；

2）取混勻后的樣品液0.5ml加入0.5ml去離子水，混勻；

3）取50μl進行分析。

    樣本稀釋倍數：10    檢測下限：0.2ppb

5.3.6 葡萄酒、醬油、醋處理方法

1）取2ml樣品，加入2ml蒸餾水，再加入10ml三氯甲烷（或二氯甲烷），振蕩5分鐘，室溫4000轉/分離心10分鐘；

2）取下層液體1ml于50-60℃氮氣下吹干；

3）加入0.5ml樣品提取液充分溶解干燥物，再加入0.5ml去離子水，混勻；

5）取50μl進行分析。

樣本稀釋倍數：5    檢測下限：0.1ppb

6 酶聯免疫試驗步驟

    將所需試劑從4℃冷藏環境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結晶需恢復到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

實驗開始前，用去離子水將20×濃縮洗滌液按20倍稀釋成工作洗滌液。

6.1 編    號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

6.2 加樣反應：加標準品或樣本50μl/孔到各自的微孔中，然后加酶標記物50μl/孔，再加入50μl/孔的抗體工作液，用蓋板膜封板，輕輕振蕩5秒混勻，25℃反應30分鐘。

6.3 洗    滌：小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，用工作洗滌液250μl/孔充分洗滌5次，每次間隔30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6.4 顯    色：每孔加入底物液A 50μl，再加底物液B 50μl，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘。

6.5 終    止：每孔加入終止液50μl，輕輕振蕩混勻，終止反應。

6.6 測吸光值：用酶標儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應在終止反應后10分鐘內完成。

7 結果分析

7.1 百分吸光率的計算

    標準液或樣本的百分吸光率等于標準液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

A—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb標準溶液的平均吸光度值

7.2 標準曲線的繪制與計算

    以標準液百分吸光率為縱坐標，對應的標準液濃度（ppb）的對數為橫坐標，繪制標準液的半對數曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中待測物的實際濃度。

    若利用試劑盒專業分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（歡迎來電索?。?/span>

8 注意事項

8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導致所有標準的OD值偏低。

8.2 在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會出現標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。

8.3 混合要均勻，洗板要徹底，在ELISA分析中的再現性，很大程度上取決于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。

8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

8.6 顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質。

8.7 反應終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。

9 貯藏及保存期

儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。

保 質 期：該產品有效期為1年，生產日期見包裝盒。