己烯雌酚檢測試劑盒（ELISA）

1原理及用途

己烯雌酚是甾類同化激素，被大量用于促進反芻動物的生長。但由于己烯雌酚存在明顯的致癌性，歐美等發達國家已相繼禁止或嚴格禁止使用。我國農業部第235號文件中規定，動物源性食品中己烯雌酚的殘留限量為不得檢出。

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測組織樣本中的己烯雌酚（Diethylstilbestrol，DES），試劑盒由預包被偶聯抗原的酶標板、酶標記物、抗體、標準品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標準品或樣品溶液，樣本中的己烯雌酚和酶標板上預包被偶聯抗原競爭抗己烯雌酚抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含己烯雌酚含量成負相關，與標準曲線比較即可得出樣本中己烯雌酚的殘留量。

2 技術指標

2.1 試劑盒靈敏度：0.05ppb(ng/ml)  

2.2 反應模式：25℃，30min～30min～15min

2.3 檢測下限：

組織（蝦、魚）………………………0.2ppb

豬肉/肝、雞肉/肝……………………0.5ppb

2.4 交叉反應率：

己烯雌酚………………………………100%

雙烯雌酚………………………………38.5%

己烷雌酚………………………………8.5%

己炔雌二醇……………………………<0.1%

雌三醇…………………………………<0.1%

 2.5 樣本回收率：

組     織   ……………………… 85%±10%

3 試劑盒組成

主要成分

標準品濃度依次為: 0ppb、0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35ppb、4.05ppb

4 需要的器材和試劑

4.1 儀器：酶標儀、打印機、均質器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：單道20μl-200μl，100μl-1000μl、多道300μl

4.3 試劑：甲醇、乙腈、氫氧化鈉、氯仿（三氯甲烷）、丙酮、濃磷酸（含量85%）

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知：

實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實驗結果。

5.2 配液：

配液1：6M H₃PO₄ 溶液

100ml 濃H₃PO₄（含量85%）加去離子水150ml混合均勻。

配液2：2M NaOH溶液

    8gNaOH加去離子水100ml溶解。

配液3：40%甲醇

    V甲醇：V去離子水=2:3

配液4：乙腈-丙酮混合液

    V乙腈：V丙酮=4:1

5.3 樣本前處理步驟：

5.3.1 組織（雞、鴨、豬肉/豬肝、蝦、魚)樣本處理方法 

1）稱取2±0.05g勻漿后的樣本，加入6ml乙腈-丙酮混合液，振蕩2min，15℃4000r/min離心10min；

2）取3ml上清液，60℃氮氣/空氣吹干；

3）加入0.5ml氯仿（三氯甲烷），振蕩20s，加入2ml 2M NaOH，振蕩30s，4000r/min離心5min；

4）取上清液1ml，加入200μl 6M H₃PO₄，振蕩5s；

5）加入3ml乙腈萃取，振蕩2min，室溫4000r/min離心10min，取1.5ml上層有機相，60℃氮氣/空氣吹干；

6）不同樣本按如下方法復溶：

A）蝦魚：用1ml 40%甲醇溶液溶解干燥的殘留物，振蕩混勻30s。取50ul用于檢測。

    樣本稀釋倍數：4   檢測下限：0.2ppb

B）豬肉/肝、雞肉/肝：用2.5ml 40%甲醇溶液溶解干燥的殘留物，振蕩混勻30s。取50ul用于檢測。

    樣本稀釋倍數：10    檢測下限：0.5ppb

6 酶聯免疫試驗步驟

    將所需試劑從4℃冷藏環境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結晶需恢復到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

實驗開始前，用去離子水將20×濃縮洗滌液按20倍稀釋成工作洗滌液。

6.1 編    號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

6.2 加樣反應：加標準品應用液或樣本50μl/孔到各自的微孔中，然后加抗體工作液50μl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光反應30分鐘。

6.3 洗    滌：將孔內液體甩干，用工作洗滌液250μl/孔充分洗滌5次，每次間隔30秒，最后用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6.4 加酶反應：加酶標記物100μl/孔，25℃避光反應30分鐘。

6.5 洗    滌：同上

6.6 顯    色：加底物液A 50μl/孔，再加底物液B 50μl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘。

6.7 終    止：加終止液50μl/孔，輕輕振蕩混勻，終止反應。

6.8 測吸光值：用酶標儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應在終止反應后10分鐘內完成。

7 結果分析

7.1 百分吸光率的計算

    標準液或樣本的百分吸光率等于標準液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

A—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb標準溶液的平均吸光度值

7.2 標準曲線的繪制與計算

    以標準液百分吸光率為縱坐標，對應的標準液濃度（ppb）的對數為橫坐標，繪制標準液的半對數曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中待測物的實際濃度。

    若利用試劑盒專業分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（歡迎來電索?。?/span>

8 注意事項

8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導致所有標準的OD值偏低。

8.2 在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會出現標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。

8.3 混合要均勻，洗板要徹底，在ELISA分析中的再現性，很大程度上取決于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。

8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

8.6 顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質。

8.7 反應終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。

9 貯藏及保存期

儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。

保 質 期：該產品有效期為1年，生產日期見包裝盒。