蘇丹紅檢測試劑盒（ELISA）

蘇丹紅檢測試劑盒（ELISA）

（酶聯免疫法）

1 原理及用途

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測番茄醬、辣椒醬、蛋等樣本中的蘇丹紅（Sudan，SUD），試劑盒由預包被偶聯抗原的酶標板、酶標記物、抗體、標準品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標準品或樣品溶液，樣本中的蘇丹紅和酶標板上預包被偶聯抗原競爭抗蘇丹紅抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含蘇丹紅含量成負相關，與標準曲線比較即可得出樣本中蘇丹紅的殘留量。

2 技術指標

2.1 試劑盒靈敏度：0.3ppb(ng/ml)

2.2 反應模式：25℃，30min～30min～15min

2.3 檢測下限：

番茄汁/番茄醬/辣椒醬………………12ppb

辣椒粉(辣椒面）/飼料………………120ppb

蛋類(雞蛋、鴨蛋、鵝蛋）……………30ppb

2.4 交叉反應率：

蘇丹紅…………………………………100%

對位紅…………………………………123%

羅丹明…………………………………8%

 2.5 樣本回收率：

番茄汁/番茄醬/辣椒醬…………80% ±15%

辣椒粉(辣椒面）/飼料…………95% ±15%

蛋類(雞蛋、鴨蛋、鵝蛋）………80% ±15%

3 試劑盒組成

主要成分

標準品濃度依次為: 0ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb、24.3ppb

4 需要的器材和試劑

4.1 儀器：酶標儀、打印機、均質器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：單道20μl-200μl，100μl-1000μl、多道300μl

4.3 試劑：甲醇

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知：

實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實驗結果。

5.2 配液：

配液1：10%甲醇

    取10ml甲醇加入90ml去離子水中，混勻，密閉備用。

5.3 樣本前處理步驟：

5.3.1 番茄汁/番茄醬/辣椒醬

1）稱取2±0.05g均質樣品于離心管中，加入10ml甲醇，振蕩5min，室溫下4000r/min以上離心10min；

2）取100μl上清液與700μl去離子水混勻；

3）取50μl用于分析。  

    樣本稀釋倍數：40    檢測下限：12ppb

5.3.2 辣椒粉、飼料

1） 稱取1±0.05g樣本于離心管中，加入10ml甲醇，震蕩5min，室溫下4000r/min以上離心10min；

2）取20μl上清液與780μl 10%甲醇混勻；

3）取50μl液體用于分析。

    樣本稀釋倍數:400    檢測下限：120ppb  

5.3.3 蛋類(雞蛋、鴨蛋、鵝蛋）

1）用均質器低速均質蛋類樣本（熟蛋取樣蛋黃，生蛋取樣全蛋）；

2）稱取1±0.05g均質后蛋類樣本于離心管中，加入9ml甲醇，振蕩5min（劇烈振蕩，將成團樣本振散開并充分混勻），15℃下4000r/min以上離心10min；

3）取100μl上清液與900μl去離子水混勻；

4）取50ul用于分析。

    樣本稀釋倍數:100    檢測下限：30ppb  

備注：如樣品嚴重污染、較多雜質或殘留物嚴重超標，應進

一步稀釋后重新分析。

6 酶聯免疫試驗步驟

    將所需試劑從4℃冷藏環境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結晶需恢復到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

實驗開始前需配制：

1）用去離子水將20×濃縮洗滌液按20倍稀釋成工作洗滌液。

2）配制標準品應用液；低濃度的標準品不穩定，需現配現用。

在0ppb的瓶中加10%甲醇3ml，0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb的瓶中分別加10%甲醇2ml，24.3ppb的瓶中加10%甲醇2.93ml。

標準液6：取1.0ppm高濃度標準品溶液73ul加入裝有2.93ml 10%甲醇的24.3ppb的瓶中，蓋緊，混勻，濃度即為24.3ppb。

標準液5：取1ml標準液6加入裝有2ml 10%甲醇的8.1ppb的瓶中，蓋緊，混勻，濃度即為8.1ppb。

標準液4：取1ml標準液5加入裝有2ml 10%甲醇的2.7ppb的瓶中，蓋緊，混勻，濃度即為2.7ppb。

標準液3：取1ml標準液4加入裝有2ml 10%甲醇的0.9ppb的瓶中，蓋緊，混勻，濃度即為0.9ppb。

標準液2：取1ml標準液3加入裝有2ml 10%甲醇的0.3ppb的瓶中，蓋緊，混勻，濃度即為0.3ppb。

標準液1：直接使用10%甲醇的，濃度即為0ppb。

6.1 編    號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

6.2 加樣反應：加標準品或樣本50μl/孔到各自的微孔中，然后加抗體工作液50μl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光反應30分鐘。

6.3 洗    滌：將孔內液體甩干，用工作洗滌液250μl/孔充分洗滌5次，每次間隔30秒，最后用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6.4 加酶反應：加酶標記物100μl/孔，25℃避光反應30分鐘。

6.5 洗    滌：同上

6.6 顯    色：加底物液A 50μl/孔，再加底物液B 50μl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘。

6.7 終    止：每孔加入終止液50μl，輕輕振蕩混勻，終止反應。

6.8 測吸光值：用酶標儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應在終止反應后10分鐘內完成。

7 結果分析

7.1 百分吸光率的計算

    標準液或樣本的百分吸光率等于標準液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

A—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb標準溶液的平均吸光度值

7.2 標準曲線的繪制與計算

    以標準液百分吸光率為縱坐標，對應的標準液濃度（ppb）的對數為橫坐標，繪制標準液的半對數曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中待測物的實際濃度。

    若利用試劑盒專業分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（歡迎來電索?。?/span>

8 注意事項

8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導致所有標準的OD值偏低。

8.2 在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會出現標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。

8.3 混合要均勻，洗板要徹底，在ELISA分析中的再現性，很大程度上取決于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。

8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

8.6 顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質。

8.7 反應終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。

9 貯藏及保存期

儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。

保 質 期：該產品有效期為1年，生產日期見包裝盒。